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免疫沉淀CHIP實驗中要注意的事項有哪些?
點擊次數:744 更新時間:2022-09-14
  染色質免疫沉淀技術(ChIP)通過與染色質片段共沉淀技術,在體內檢測與特異蛋白質結合的DNA片段。ChIP技術最大的優點就是在活體細胞狀態下研究了蛋白質和目的基因結合狀況,減少了體外實驗的誤差。在活體細胞中,先對與調節蛋白結合的染色質進行分離,然后隨機剪切染色質,用調節蛋白的抗體沉淀目的染色質,最后用QPCR、DNA測序的方法進行檢測研究。
  因為免疫沉淀的目的主要是通過抗體和目的蛋白相互作用從而捕獲目的蛋白,所以實驗中要注意的關鍵點是抗體和目的蛋白相互作用的效果。其主要受抗體的結合能力,目的蛋白和抗體的可接觸性兩個因素影響。所以免疫沉淀實驗中的關鍵因素是抗體的選擇以及裂解緩沖液中的配方。對于前者而言,抗體所針對的作用表位必須處于目的蛋白表面,對抗體結合力的要求和免疫印跡或者免疫熒光相比要高得多;對于后者而言,主要考慮因素是緩沖液中的去垢劑成分能否在不破壞目的蛋白天然構像的情況下(不影響目的蛋白和抗體的相互作用效果)將目的蛋白從細胞局部定位(比如位于某些細胞器中)中有效釋放出來。
  在所有免疫沉淀相關實驗中,抗原的起始濃度相對其它免疫相關實驗(WB和IF等)要低得多,所以對抗體的親和力相對其它實驗提出了更高的要求,這就需要使用高親和力的抗體去進行免疫沉淀相關實驗。同時,由于免疫沉淀相關實驗主要是在生理條件下進行,所以需要抗體識別蛋白的天然表面構像,因此選擇的抗體其針對的抗原決定簇需要暴露在蛋白表面。

滬公網安備 31011802001676號

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